La traduzione integrale del brevetto del Dottor Gho, Ricercatore olandese diventato recentemente famoso per la sperimantazione di una nuova tecnica di moltiplicazione di capelli e registrata in Giugno negli USA.
Descrizione:
Questa invenzione in primo luogo si riferisce ad un metodo per la riproduzione dei capelli. Essa fa anche riferimento al metodo di coltivazione delle cellule di capelli in fase anagen oltre che ad un veicolo adatto alla coltivazione di cellule del follicolo capillifero, ad un metodo per la preparazione di un tale veicolo e ad un veicolo precursore.
Un metodo per la riproduzione dei capelli viene descritto nel brevetto europeo 0 236 014 in cui le cellule di un follicolo epidermico del tipo di capello indicato vengono estratte dalla cute del cuoio capelluto di un paziente. Queste vengono poi coltivate in un veicolo di coltura in cui preferibilmente vi siano agenti di crescita. In uno stadio successivo, un’apertura viene praticata nell’epidermide del cuoio capelluto del paziente e, tramite suddetta apertura, le cellule coltivate del follicolo epidermico possono essere introdotte nel derma prossimo all’epidermide. Lo svantaggio di questo metodo risiede nel fatto che si basa su una procedura invasiva e che le cellule non vengono inserite seguendo una direzione accurata; ne consegue che molte cellule risultino inutilizzabili e che la probabilità di rigenerazione del capello sia inferiore. E’ da precisare che nell’impiego di questa metodologia non si fa uso di cellule autologhe di tipo CD34.sup.+.
Le strutture essenziali per la crescita del capello sono i follicoli capilliferi presenti nella pelle. Le cellule dei follicoli capilliferi o cheratinociti si riproducono da questi follicoli capilliferi e, durante il passaggio alla superficie della pelle, il citoplasma di dette cellule viene convertito tramite un’ampia gamma di complessi processi in quel materiale solido ma resiliente (elastico) che viene definito capello.
Il ciclo di crescita del capello può essere suddiviso in tre fasi: fase anagen o fase di crescita, fase catagen o fase transitoria e fase telogen o fase di morte. Il follicolo capillifero è unico nel suo genere data la natura del suo ciclo di formazione e crescita. In particolar modo, il follicolo capillifero è l’unica parte del corpo a possedere un nucleo di crescita dal quale nuovi capelli possono essere generati dopo la rimozione dei vecchi.
Si sa che le cellule del follicolo capillifero provenienti da un capello umano rimosso possono essere coltivate. Si è altresì a conoscenza del fatto che è possibile utilizzare tali cellule di coltura per costituire un?epidermide differenziata o una completamente sviluppata tanto in vitro quanto in vivo. Le cellule coltivate del follicolo pilifero dei topi possono stimolare crescita di pelo allorquando le suddette cellule vengano impiantate negl’animali di prova. Fin ora, comunque, non è stato ancora dimostrato che sia possibile raggiungere negl’esseri umani una nuova crescita di capelli nelle zone dove questi ? senza che lo si desideri – non crescano più, grazie all’ausilio di cellule autologhe coltivate del follicolo capillifero.
E’ un dato di fatto che le persone generalmente ritengano che la calvizie sia una condizione sgradevole da un punto di vista cosmetico ed estetico. Ciò non di meno, la calvizie si manifesta assai di frequente e si sa bene che negl’uomini, in particolar modo, la calvizie avanza sempre più via via che questi invecchiano. Questa tipologia di calvizie viene usualmente definita alopecia androgenetica. Ora come ora, però, non si sa con precisione perché certe parti del cuoio capelluto siano soggette ad alopecia androgenetica ed altre no. Ad ogni modo anche nelle donne accade regolarmente che i capelli si diradino e minaccino di scomparire in gran parte. Nelle donne questa situazione è ancora più spiacevole da un punto di vista estetico.
Una tecnica a noi nota per contrastare la calvizie è quella del trapianto di capelli. Con questa procedura i capelli vengono rimossi assieme alla pelle da un’area donatrice folta, in genere localizzata sulla parte posteriore del capo, e vengono separati in piccole unità che comprendono, in genere, da uno a tre capelli. Queste parti vengono poi impiantate nella zona calva (area recettrice). Lo svantaggio di questo metodo generalmente sta o nel costo o nelle possibilità dell’area donatrice. In particolar modo, quando i capelli vengono rimossi da questa zona, non tornano a crescere di nuovo. La tecnica del trapianto perciò offre possibilità limitate.
Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire una tecnica coll’ausilio della quale le chiazze calve possano venire ripopolate di capelli nuovi e che, tuttavia, non presenti gli svantaggi del trapianto di capelli classico messi in evidenza precedentemente. Un ulteriore obbiettivo dell’invenzione è quello di fornire un metodo col quale si possa ottenere una nuova crescita di capelli sulle chiazze calve negl’esseri umani grazie alle cellule coltivate del follicolo capillifero. In più, si mira altresì a fornire una metodologia relativamente semplice da applicare.
I suddetti obbiettivi si possono raggiungere utilizzando il metodo basantesi sull’invenzione donde i capelli risultano essere come riprodotti. Nello specifico, secondo quanto è sostenuto dall’invenzione, i capelli che vengono rimossi da un’area donatrice (in modo tale che nuovi capelli ricrescano al loro posto naturalmente) vengono utilizzati per coltivare nuove cellule del follicolo capillifero sicché si possono generare nuovi capelli.
L’invenzione, dunque, si riferisce ad un metodo per la riproduzione dei capelli e comprende i seguenti passaggi:
(1) rimozione di capelli in fase anagen da una o più regioni donatrici in modo tale che il bulbo caratteristico di tale fase rimanga annesso al capello rimosso (2) coltura delle cellule del follicolo capillifero derivanti dal capello rimosso in condizioni tali che possano essere in grado di moltiplicarsi (3) impianto delle cellule del follicolo capillifero nelle aree recettrici, ove: – il capello in fase anagen venga rimosso dall’area donatrice tramite strappo – le cellule del follicolo capillifero vengano coltivate in un veicolo di coltura che sia eventualmente provvisto di almeno (a) una fila di mastociti umani e/o cellule coltivate autologhe di tipo CD34.sup.+ o (b) uno o più estratti di file di mastociti umani e/o cellule di tipo CD34.sup.+ e/o (c) agenti stimolatori della crescita – le cellule del follicolo capillifero coltivate e/o le cellule coltivate autologhe di tipo CD34.sup.+ siano impiantate nei pori dell’area recettrice.
Si badi, solo una cellula del follicolo capillifero o una cellula coltivata autologa di tipo CD34.sup.+ o una combinazione di queste due può essere introdotta ancorché una pluralità di cellule venga menzionata nella descrizione.
La metodologia basata sull’invenzione ha il grande vantaggio che nelle chiazze calve la crescita dei capelli si ottiene ex novo senza che la zona donatrice ne faccia le spese.
Il passaggio (1) del metodo, secondo quanto prescritto nell’invenzione, comprende la rimozione dei capelli in fase anagen dalla zona donatrice ove questi sono situati. Come esplicato in precedenza, la crescita dei capelli consiste di tre fasi: una fase anagen, una fase catagen ed una telogen. Solo i capelli in fase anagen risultano adatti per questa metodologia. In confronto ai capelli nelle fasi catagen e telogen i capelli nella fase anagen sono caratterizzati da un bulbo generalmente pigmentato di forma caratteristica alla base. Questa è conoscenza comune e, ad un occhio esperto, il capello in fase anagen è perciò immediatamente riconoscibile. Qualora sussistessero dubbi di sorta, l’uso d?un microscopio permette di giungere ad una risposta definitiva. La rimozione di capelli in fase anagen può essere pertanto effettuata in diversi modi, purché il bulbo caratteristico dei capelli in fase anagen rimanga annesso al capello rimosso.
Il numero di capelli in fase anagen di cui s’abbisogna al fine di coltivare una quantità adeguata di cellule del follicolo capillifero è sostanzialmente privo di limiti specifici cosicché, di principio, si potrebbe coltivare un numero illimitato di cellule del follicolo capillifero da un solo capello. In particolar modo, si possono ottenere sottoculture dalle prime colture e, ancora, ulteriori sottoculture si potrebbero ricavare da queste ultime. In pratica, una disponibilità di base che oscilli tra i tre ed i dieci capelli è da considerarsi abbondante. I capelli che alla fine si formeranno nell’area recettrice dalle cellule del follicolo capillifero coltivato assumeranno le caratteristiche dei capelli della zona donatrice dalla quale le cellule dei follicoli capilliferi erano state prelevate e coltivate. Per questa ragione, una zona non soggetta ad alopecia androgenetica è da considerasi adatta come zona donatrice. Comunque sia, ciò non è fondamentale.
Siccome la differenza tra i capelli nei varî stadî di crescita può essere osservata con sufficiente perspicuità una volta che i capelli siano stati rimossi, i capelli dell’area donatrice vengono strappati dalla zona donatrice e selezionati tra quelli più idonei in fase anagen. Le pinzette, ad esempio, sono uno strumento particolarmente adatto al prelievo di capelli dall’area donatrice.
Nel passaggio (2) della metodologia, secondo quanto s’afferma nell’invenzione, i capelli vengono coltivati dai capelli rimossi in condizioni tali che i follicoli capilliferi siano in grado di moltiplicarsi. Di principio, le cellule del follicolo capillifero possono essere coltivate dai capelli tramite metodo già noto. I mezzi di coltura a questo proposito sono disponibili in commercio e qualunque additivo per la crescita utilizzato è di facile reperibilità . Tali mezzi di coltura sono altresì denominati mezzi di coltura a base di cheratinociti privi di siero e normalmente contengono amminoacidi essenziali e non, vitamine, elementi di traccia, componenti organici e sali inorganici. Questi mezzi di coltura, inoltre, possono essere combinati con additivi per la crescita che contengono fattori di crescita, ormoni, antibiotici ed estratti di tessuto come ad esempio BPE (Bovine Pituitary Extract, estratto di pituitaria bovina), insulina, idrocortisone, HEGF (Human Epidermal Growth Factor, fattore di crescita epidermica umano), TGF (Transformal Growth Factor, fattore di crescita trasformale), L-cisteina, L-leucina e gentamicina. Secondo l’invenzione, dunque, s’otterrebbero risultati particolarmente soddisfacenti quando nel passaggio (2) venga fatto uso di un veicolo di coltura che, in aggiunta al noto veicolo di coltura di cui sopra, sia integrato da uno o più additivi per la crescita e/o venga integrato da una fila di mastociti umani e/o cellule coltivate di tipo CD34.sup.+ autologhe (cellule positive CD34.sup.+) o uno o più estratti di file di mastociti umani e/o di cellule CD34.sup.+ e/o agenti di stimolazione della crescita. E’ meglio privilegiare l’uso di cellule CD34.sup.+ poiché codeste cellule sono naturali del corpo umano. I mastociti umani sono sostanzialmente conosciuti. Contengono varî fattori di crescita e sono prodotti e consumati in diverse locazioni del corpo. Gli estratti della fila di mastociti umani e/o di CD34.sup.+ autologo e/o di agenti stimolatori della crescita contengono fattori di crescita. Allo stato attuale, in ogni caso, tali estratti della fila di mastociti umani e/o di CD34.sup.+ autologo e/o di agenti stimolatori della crescita non sono stati ancora utilizzati per i mezzi di coltura di cellule del follicolo capillifero. Una delle file di mastociti umani che può essere utilizzata è la HMC-1 (Human Mast Cell line 1, cellula mast umana 1) o una fila di cellule derivata da essa come i sottocloni 5C6 e KU812. Le file di mastociti come la HMC-1 e i sottocloni di essa sono reperibili in commercio. Secondo quanto specificato nell’invenzione, in luogo dei mastociti, possono essere utilizzate cellule coltivate di tipo CD34.sup.+ o la combinazione di due o più di questi tipi di cellule.
Gli estratti della fila di mastociti umani e/o di CD34.sup.+ autologo e/o di agenti stimolatori della crescita possono essere adeguatamente introdotti nel veicolo tramite l’aggiunta di almeno un agente degranulante al veicolo di coltura di cheratinociti privi di siero contenente la fila di mastociti umani, un sottoclone di essa e/o di CD34.sup.+ autologo e/o di agenti stimolatori della crescita. Può essere inoltre aggiunto del sale inorganico per ottimizzare l’azione dell’agente degranulante. Il CaCl.sub.2 è un sale adatto a questo scopo. L’agente degranulante, dunque, taglia il mastocito o le cellule coltivate di tipo CD34.sup.+ autologhe in parti più ridotte (degranulazione) e come risultato i fattori di crescita vengono a trovarsi nel veicolo di coltura. A degranulazione avvenuta, i residui dei mastociti e/o delle cellule coltivate di tipo CD34.sup.+ autologhe possono essere rimossi ad esempio tramite centrifugazione. Il veicolo condizionato risultante può essere utilizzato per coltivare le cellule del follicolo capillifero.
Gli agenti degranulanti sono conosciuti e possono essere suddivisi approssimativamente in tre gruppi:
– ormoni, come estrogeni e bradichinina
– neurotrasmettitori ed antìgeni, come l’apitoxina
– sostanza P e Ig E ed agenti sintetici come il composto 48/80 e ionoforo A23187.
I sopraccitati agenti degranulanti, che sono in grado di scomporre i mastociti (opzionali), sono adeguati all’uso previsto dall’invenzione.
Un?alternativa può essere quella di preparare prima separatamente gli estratti o le file di mastociti umani e/o di CD34.sup.+ autologo e/o di agenti stimolatori della crescita e di aggiungere questi estratti così come sono al veicolo di coltura basato su cheratinociti privi di siero.
Le condizioni in cui le cellule del follicolo capillifero vengono coltivate nel passaggio (2) possono variare sostanzialmente e sono dipendenti, tra le altre cose, dal veicolo utilizzato. E’ stato scoperto, però, che la coltura delle cellule del follicolo capillifero ad una temperatura di 30-40 gradi centigradi (meglio se all’interno di un incubatore di modo che la temperatura rimanga costante, in un’atmosfera saturata d?acqua e che contenga 3-10% di CO.sub.2 per volume in aggiunta agl’altri usuali componenti dell’aria nelle normali proporzioni) garantisce risultati soddisfacenti. Queste condizioni non sono in alcun caso restrittive sicché v?è anche la possibilità di utilizzare condizioni differenti. Il periodo di coltura varia a seconda della coltura, in genere da 1 ora sino a 40 giorni. Affinché si ottengano buoni risultati è opportuno sostituire il veicolo con uno nuovo ogni 2-5 giorni.
Il passaggio (2) del metodo secondo l’invenzione può essere portato a termine utilizzando un?unica coltura, ma v?è anche la possibilità di realizzazione tramite varî sottopassaggi attraverso diverse sottocolture della/e coltura/e iniziale/i. Ciò si ottiene prendendo un numero sufficientemente elevato di cellule del follicolo capillifero dalla coltura principale quando questa contenga un numero sufficiente di cellule del follicolo capillifero. Le cellule del follicolo capillifero provenienti dalla coltura principale vengono coltivate a turno, meglio se ? ma non necessariamente – nel medesimo veicolo di coltura di quello in cui la coltura d?origine era stata coltivata. Nel frattempo v?è la possibilità , se lo si voglia, di mettere a coltura ulteriori colture partendo dalle suddette sottocolture ecc?ecc?
Una volta che le cellule del follicolo capillifero siano state coltivate, esse debbono essere distaccate dal sostrato su cui erano state coltivate. La qual cosa si può realizzare attraverso metodi conosciuti, ad esempio facendo uso di una soluzione acquosa di tripsina allo 0.1-0.5% in peso, oppure in combinazione con una soluzione di EDTA allo 0.01-0.05% in peso nel PBS (Phosphate Buffered Saline, soluzione salina tamponata di fosfato). Tali metodi sono di per sé conosciuti. Prima che le cellule coltivate del follicolo capillifero siano utilizzate nel passaggio (3) la maggior parte delle cellule e/o delle cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) possono eventualmente essere rimosse.
Nel passaggio (3) del metodo secondo l’invenzione, le cellule del follicolo capillifero coltivate e/o le cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) vengono impiantate nella pelle della regione recettrice. E’ stato riscontrato che si ottengono buoni risultati quando le cellule del follicolo capillifero coltivate e/o le cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) vengono impiantate direttamente nei pori della regione recettrice. Se i pori risultano difficili a individuarsi, eventualità verificantesi in caso di pelle piuttosto pallida, questi possono essere evidenziati applicando un liquido (generalmente di colore giallo) sulla cute dell’area recettrice la quale diventerà di colore più scuro nei luoghi ove sono situati i pori come risultato di una secrezione della traspirazione da parte delle ghiandole sudoripare presenti nei pori stessi. Per citare un esempio di liquido simile consideriamo la soluzione 1-10% di o-ftaldialdeide in xilene oppure in etere etile come è stato descritto da L. Juhlin e W. B. Suelley su Nature del 28 Gennaio 1967, a pagina 408.
E’ preferibile introdurre una quantità di sospensione di cellule coltivate del follicolo capillifero e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) in ciascun poro e che la suddetta quantità contenga un numero sufficiente di cellule del follicolo capillifero coltivate e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) perché il follicolo capillifero possa svilupparsi e permettere ad un nuovo capello di crescere. Il numero di cellule del follicolo capillifero coltivate e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) necessario per far sì che il follicolo capillifero si formi è strettamente dipendente dal grado di differenziazione o di crescita potenziale delle cellule coltivate. Naturalmente, un numero inferiore di cellule coltivate risulterà necessario qualora le cellule del follicolo capillifero coltivate e/o le cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) avessero un grado relativamente alto di differenziazione. V?è un’ampia gamma di fattori che possono influenzare il grado di differenziazione delle cellule coltivate del follicolo capillifero e/o delle cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate). Ad esempio, il veicolo utilizzato ed il tempo impiegato per la coltura sono fattori rilevanti. E’ consigliabile utilizzare una sospensione di cellule del follicolo capillifero coltivate e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) nel veicolo in cui dette cellule sono state coltivate. E’ bene anche che la sospensione abbia una concentrazione di cellule del follicolo capillifero che sia di 0.015-5 .mu.l (da 0.1 a 0.5.mu.l di soluzione per poro è da ritenersi sufficiente). Una tale quantità va poi iniettata nel poro tramite l’ausilio di uno strumento di misurazione provvisto di un ago cavo (è da privilegiarsi un ago di tipo Gauche 18-40). Lo strumento di misurazione utilizzato può essere, per esempio, un sistema di misurazione elettronico a pipetta, un ago di tipo Gauche 18-40 sistemato all’estremità del tubo per la misurazione o pipetta. Vista la dimensione media dei pori sul cuoio capelluto è da raccomandarsi l’uso d?un ago cavo di tipo Gauche da 34. In ogni caso v?è la possibilità di fare uso di aghi di dimensione maggiore o inferiore in altre parti del corpo. Si può anche iniettare la sospensione tramite un sistema (elettronico) di misurazione iniettiva a ripetizione tipo penna per insulina. In tal caso si dovrebbe far uso d?un ago sviluppato ad hoc, ossia un ago ad indirizzo follicolare per introdurre le cellule nella posizione desiderata e danneggiare la pelle il meno possibile. L’ago ad indirizzo follicolare è flessibile e minuscolo e al contempo in grado d?essere seguito dal follicolo capillifero.
Durante l’iniezione della sospensione possono essere introdotte sostanze che mantengano in vita le cellule per un periodo superiore. Il Minoxidil ed agenti stimolatrici della crescita similari ne sono un esempio.
L’invenzione fa altresì riferimento al metodo di coltura delle cellule del follicolo capillifero derivate da capelli in fase anagen; uno o più capelli in fase anagen vengono posti in un veicolo il quale è aggiunto ad un adeguato veicolo di coltura di cheratinociti privi di siero e, opzionalmente, provvisto di una fila di mastociti umani e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) o uno o più estratti delle file di mastociti umani e/o delle cellule CD34.sup.+ autologhe e/o agenti stimolatori della crescita. Il metodo secondo cui s’ottiene codesto veicolo è già stato descritto in precedenza.
Per quanto concerne le preferenze riguardanti i varî costituenti del veicolo da usarsi e le condizioni di coltura, queste sono le medesime per le quali s’è optato per il veicolo e le condizioni del passaggio (2) del metodo precedentemente delineato. Col che, è bene preferirsi l’utilizzo di una fila di mastociti, un sottoclone di essa e/o cellule CD34.sup.+ autologhe e/o agenti stimolatori della crescita. Una temperatura di 30-40 gradi centigradi in un’atmosfera saturata d?acqua che contenga il 3-10% di CO.sub.2 per volume è da ritenersi una condizione di coltura adeguata.
Inoltre, l’invenzione fa riferimento ad un veicolo di coltura di cellule del follicolo capillifero provenienti da capelli in fase anagen ed a un metodo per la preparazione del detto veicolo. Codesto veicolo, secondo quanto prescrive l’invenzione, comprende almeno un veicolo adeguato di coltura di cheratinociti privi di siero eventualmente provvisto di una fila di mastociti umani e/o cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) o estratti delle file di mastociti umani e/o cellule CD34.sup.+ e/o agenti stimolatori della crescita. La peculiarità di questo veicolo è, nello specifico, quella di contenere fattori di crescita originanti da una o più file di mastociti umani e /o cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate).
Un veicolo adeguato preferibilmente comprende un veicolo di coltura di cheratinociti privi di siero ed estratti della fila di mastociti umani HMC-1 o una fila di cellule derivate da essa come ad esempio 5C6 o KU812 e/o cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate). Dettagli ulteriori quanto ai costituenti del veicolo, secondo ciò che è prescritto dall’invenzione, sono stati precedentemente forniti.
Il metodo per la preparazione del veicolo descritto consta dei seguenti passaggi:
(a) aggiunta a un veicolo di coltura di cheratinociti privi di siero di almeno una fila di mastociti umani, un sottoclone di essa e/o cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) e/o agenti stimolatori della crescita ed eventualmente un agente degranulante se si preferisce in combinazione con un sale organico come ad esempio il CaCl.sub.2. (b) degranulazione di mastociti umani, sottocloni di essi e/o cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) acciocché i fattori di crescita vengano rilasciati nel veicolo (c) eventuale rimozione dei mastociti umani e/o delle cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) derivanti dal veicolo, ad esempio tramite centrifugazione, operata la quale s’otterrebbe il veicolo (condizionato).
Secondo quanto viene prescritto nell’invenzione i mastociti e/o le cellule CD34.sup.+ autologhe e/o i residui di essi/e sono da rimuoversi dal veicolo.
Le condizioni tali perché questo metodo possa essere attuato non appaiono particolarmente problematiche e risulteranno chiare a chiunque sia esperto in materia. L’agente degranulante utilizzato nel passaggio (a) è preferibile che sia il Composto 48/80 in combinazione col CaCl.sub.2.
In conclusione, l’invenzione si riferisce ad un veicolo precursore per la coltura di cellule del follicolo capillifero derivanti da capelli in fase anagen il cui veicolo comprende almeno un veicolo adeguato per la coltura di cheratinociti privi di siero ed eventualmente provvisti di una fila di cellule di tipo mast umane e/o di cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) o uno o più estratti di file di mastociti umani e/o di cellule CD34.sup.+ e/o agenti stimolatori della crescita e/o almeno un agente degranulante. Il suddetto veicolo precursore può essere utilizzato come tale per la preparazione di un veicolo condizionato adeguato per la coltura di cellule del follicolo capillifero ottenute da capelli in fase anagen. Tutto ciò si ricava semplicemente tramite un processo di degranulazione laddove e la fila di mastociti umani e/o le cellule CD34.sup.+ autologhe (coltivate) sia/no presente/i, come pure l’agente degranulante. Se una delle due è assente, il componente mancante deve essere aggiunto prima che la degranulazione delle mastociti abbia luogo.
